應用于動脈和內臟大出血的止血材料要求具有良好的止血性能、濕態組織粘附性以及力學性能。本研究將殼聚糖（CS）與絲素蛋白（SF）通過單寧酸（TA）交聯制備出結構穩定的水凝膠，其可以實現各種臟器出血模型在短時間內止血。本研究制備的水凝膠作為一種優良的止血密封劑，在急性創面和大出血情況下具有顯著的優勢。
一、論文信息
該論文共同第一作者為清源創新實驗室生物分析與納米醫學科研團隊成員、福州大學喬紫雯、福州大學呂雪麗、福建省立醫院小兒外科主任醫師何少華。通訊作者為清源創新實驗室生物分析與納米醫學科研團隊負責人、福州大學楊黃浩教授及團隊成員張進教授、中科院長春應化所丁建勛教授。
論文以“A mussel-inspired supramolecular hydrogel with robust tissue anchor for rapid hemostasis of arterial and visceral bleedings”為題，發表于在Materials Science，Biomaterials領域排名第一的高質量英文期刊Bioactive Materials（DOI:10.1016/j.bioactmat.2021.01.039）。
二、研究內容
研究人員制備了一種10s內即可完成超分子交聯過程的生物可降解CS/TA/SF水凝膠，并將其應用于大鼠、兔各種大出血模型的快速止血。CS/TA/SF水凝膠的超交聯網絡，是由CS支鏈中的氨基/羥基、SF中的酰胺基與TA中的酚羥基分別形成氫鍵而構成的。TA作為一種天然的生物分子基粘合劑，對蛋白質具有較高的結合力，使得CS/TA/SF水凝膠能夠與濕組織形成可逆的強相互作用。引入的CS組分可以加快血液吸收、并且具有良好的凝血能力和高的紅細胞粘附性，進一步促進了大動脈止血的效率（示意圖1）。
Scheme 1. Schematic illustration of (A) preparation and (B) cross-linking-network structure of CS/TA/SF hydrogel for massive arterial and visceral hemorrhage.
如圖1所示，CS/TA/SF超分子水凝膠微觀形貌呈現多孔結構，具有出色的機械性能，包括拉伸強度、楊氏模量和斷裂伸長率。這主要是由于CS/SF優異的延展性和CS/TA/SF三組分超分子交聯網絡的存在。另一方面，CS/TA/SF凝膠在接觸角實驗中展現出優越的親水性和吸濕性，主要歸因于CS是一種親水性聚合物，含有許多羥基（?OH）和胺（?NH2）基團，而含酚羥基的TA也具有高度親水性，在水中表現出良好的溶解性。此外，高度交聯度CS/TA/SF水凝膠含有的穩定多孔結構有利于氣體（O2和CO2）交換，吸收來自損傷表面的滲出物并抑制滲出物積聚，最終把傷口部位的有害影響降到最低。
Fig. 1. Structural and physical properties of CS/TA/SF hydrogels with different weight ratios. (A) Photographs showing gross morphologies of hydrogels onto polypropylene dish. (B) SEM images of hydrogel after lyophilization. Right is the higher magnification image of the retangular area in the left one. (C) Tensile testing photograph of hydrogel. (D) Representative tensile stress? strain curves. (E) Comparison of tensile strength, strain, and Young’s modulus of hydrogels with different weight ratios. (F) Contact angles for water droplet on hydrogel surface. (G) Conformational analysis of hydrogel by FTIR spectroscopy. (H) 1 H NMR spectra of hydrogel. All statistical data are represented as mean ± SD (n = 3; ***P < 0.001).
理想的止血材料應具有濕態強黏附作用，以促進快速凝血，減少失血。基于此，研究人員們通過對9組不同組分比例的CS/TA/SF水凝膠進行止血效果評價后，再分別檢驗其對濕組織的剪切黏附能力。在該體系中，一方面TA通過靜電作用和氫鍵與SF、CS中的氨基酸結合，維持了CS/TA/SF水凝膠的結構穩定性；另一方面，水溶性TA含有親水性多酚，其末端不僅能通過氫鍵進行自組裝聚集，還可與蛋白質和肽等生物分子緊密結合，保證了CS/TA/SF水凝膠超強的濕組織粘附性。這種超分子網絡結構對于吸收傷口滲出物、阻斷紅細胞和血小板作為止血劑的逃逸至關重要。如圖2所示，CS/TA/SF水凝膠的止血機理，主要是通過CS與紅細胞表面的陰離子相互作用形成陽離子團簇，從而誘導血小板聚集。其中，CS能被范德華力、靜電力、氫鍵等非特異性作用力吸附在細胞表面，加速血液流動，加快紅細胞凝血。并且，SF和TA與血小板和凝血因子的直接相互作用加速了血栓的形成，這三種材料的共聚進一步發揮了正向的協同止血作用。
Fig. 2. Hemostatic performance and wet shear adhesion strength of CS/TA/SF hydrogel with different weight ratios. (A) Photographs showing clot formation on hydrogel and polypropylene dish. (B) Schematic illustration of hemostatic mechanism. (C) Photographs showing blood pro-coagulant efficacy of hydrogels (scale bar = 10 mm). (D) Hemostatic efficiency of hydrogels. (E) Absorbance of hemoglobin tested by microplate reader. (F) Changes of hemostatic efficiency with different volume ratios of CS, TA, and SF. (G) Shear adhesion strength of hydrogel using wet porcine skin as substrate. (H) Lap shear testing photographs of hydrogel using an Instron machine 1185. (I) Photographs showing a strong adhesion of hydrogel with wet porcine skin and glass. All statistical data are represented as mean ± SD (n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).
依據正交實驗的設計原則，通過單組分水平性分析驗證止血材料性能的代表實驗，包括機械性能、親水性、吸濕性、體外止血效率以及生物安全性，最終，確定了最優組分比CS2/TA1/SF1水凝膠的成分配比（圖3A?H, J, K）。血液凝固是一個動態的過程，在這個過程中，每一個凝血元件都按一定的順序有效地進行，并最終將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白。在本研究中，紅細胞被CS2/TA1/SF1水凝膠的胺基聚集，并被超分子網絡結構纏結（圖3I）。這種CS2/TA1/SF1水凝膠很好地模擬了貽貝足蛋白的化學組成和分級納米結構，更有利于紅細胞的聚集和粘附，為天然止血材料的開發提供了有利前景。
Fig. 3. Comprehensive performance of CS2/TA1/SF1 hydrogel with the optimized weight ratio. (A) Representative tensile stress?strain curve. (B) WCAs measurement. (C) Blood clotting test and (D) BCI of control and sample groups. (E) Whole blood clotting kinetics of hydrogel. (F) Digital photographs of blood absorption kinetics test as a function of time. (G) Photographs of blood coagulation treated with CS/TA/SF hydrogel or nothing. (H) SBF and blood uptake ability of hydrogel. (I) SEM morphologies of RBCs adhesion on hydrogel. Below is the higher magnification image of the retangular area in the above one. (J) CCK-8 assay result of LO2 cells. (K) Live-dead staining images of LO2 cells encapsulated in hydrogel after seven days of incubation (scale bar = 100 μm). All statistical data are represented as mean ± SD (n = 3; ***P < 0.001).
為了證明CS2/TA1/SF1水凝膠作為臨床止血材料的潛力，將材料用于治療各種急性組織損傷，包括肝臟、心臟和動脈出血（圖4A）。在肝臟上進行快速穿刺和切除止血時，與紗布包纏止血相比較，CS2/TA1/SF1水凝膠通過交聯形成封閉劑能立即阻止失血，肉眼觀察到快速完成傷口止血。心臟創傷模型中，CS2/TA1/SF1水凝膠能夠耐受大鼠心臟跳動的強烈機械擾動，進一步證明了水凝膠的瞬時止血能力和有效的粘附性。測定肝臟、心臟創傷模型出血面積，水凝膠組出血面積僅為未治療組的1/20，更直觀的說明CS2/TA1/SF1水凝膠良好的止血效果（如圖4B?C）。
Fig. 4. Hemostatic property of CS2/TA1/SF1 hydrogel in various damage models of rats. (A) Hemostatic images of covering gauze or hydrogel on various wounds with no treatment as a control (scale bar = 1 cm). (B) Comparison of bleeding area in the liver injury model. (C) Quantitative analysis of bleeding area for each group. All statistical data are represented as mean ± SD (n = 3; ***P < 0.001).
構建兔大出血模型，進一步評估了CS2/TA1/SF1水凝膠的止血能力，為將其應用在重大死亡風險的急性大出血損傷提供理論基礎。為此，將所研制的機械強度高、血液觸發型恢復快、血液攝取量大、血液吸收速度快的注射型CS2/TA1/SF1止血水凝膠應用于兔的耳動脈、肝臟、心臟和股動脈大出血模型（如圖5）。有意義的是，在對股動脈損傷模型的研究中，CS2/TA1/SF1水凝膠不僅在動脈血壓下可穩定粘附，有效阻止出血，而且，止血后動脈的完整性和血液流動性也得以保留。在術后，CS2/TA1/SF1水凝膠也體現出良好的組織相容性，各項止血效果表明本材料具有優異的快速止血性能，是一種頗有應用前景的天然快速止血材料。
Fig. 5. Hemostatic property and post-operative analysis of CS2/TA1/SF1 hydrogel in various massive hemorrhage models of rabbits. (A) Rabbit ear artery, (B) liver, (C) cardiac puncture, and (D) femoral artery injury models treated by the hemostatic hydrogel (scale bar = 1 cm). (E) Photograph and H&E staining image of interface reaction between rabbit cardiac tissue and hydrogel. (F) MAP through a rabbit's carotid artery and ECG of a rabbit before and after surgery. (G) Comparison of hemostatic speed between CS2/TA1/SF1 hydrogel and previously-reported hemostatic dressings.
三、資助信息
上述工作得到國家自然科學基金(Grant No 51903050)、福建省自然科學基金(Grant No. 2019J01258)、高分子材料科學工程國家重點實驗室（四川大學）開放課題項目(Sichuan University, Grant No. sklpme2019-4-34)、清源創新實驗室重點項目和福州大學貴重儀器設備開放測試基金(2021T025)的資助與支持。
四、原文信息
A mussel-inspired supramolecular hydrogel with robust tissue anchor for rapid hemostasis of arterial and visceral bleedings
Ziwen Qiao a, Xueli Lv c, Shaohua He d, Shumeng Bai c, Xiaochen Liu b, Linxi Hou a, Jingjing He a, Dongmei Tong b, Renjie Ruan a, Jin Zhang a,*, Jianxun Ding e,**, Huanghao Yang b,***
a Qingyuan Innovation Laboratory, College of Chemical Engineering, Fuzhou University, 2 Xueyuan Road, Fuzhou, 350108, PR China
b MOE Key Laboratory for Analytical Science of Food Safety and Biology, State Key Laboratory of Photocatalysis on Energy and Environment, College of Chemistry, Fuzhou University, 2 Xueyuan Road, Fuzhou, 350108, PR China
c College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, 2 Xueyuan Road, Fuzhou, 350108, PR China
d Department of Pediatric Surgery, Fujian Provincial Hospital, 134 Dongjie Road, Fuzhou, 350001, PR China
e Key Laboratory of Polymer Ecomaterials, Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, 5625 Renmin Street, Changchun, 130022, PR China
Bioactive Materials 6 (2021) 2829?2840
閩公網安備35050502100027